维生素是生物生长和代谢所必需的微量有机物。分为脂溶性维生素和水溶性维生素两类。前者包括维生素A、维生素D、维生素E等,后者有B族维生素和维生素C。人和动物缺乏维生素时不能正常生长,并发生特异性病变,即所谓维生素缺乏症。目前随着国家对食品安全的重视,及国家GB5009. 82 — 2016新国标的执行,《食品安全国家标准 食品中维生素 A 、 D 、 E 的测定》,HPLC 法作为国标第一法测试维生素A,E及第四法测定维生素D的方法。

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维生素 A、D、E的测定原理:

食品或保健食品试样经过皂化后,经石油醚萃取,用液相色谱法分离,外标法定量。

 检测试样举例:市售奶粉、奶粉伴侣、米粉、婴幼儿葡萄糖和复合维生素片维生素AD制剂或鱼肝油等样品。


试剂与材料

MILLIPORE MILLI-Q 一级超纯水

无水硫酸钠:化学纯

乙醇:色谱纯

氢氧化钾:化学纯

石油醚:沸程30 ℃~60 ℃,化学纯

甲醇:色谱纯

0.22um有机系针筒式微孔滤膜过滤器

维生素A,D,E 标准品 ,美国 SIGMA 公司


仪器和设备

AGILENT  1220II-DAD梯度高效液相色谱仪

旋转蒸发器 EYELA N-1300V-WB

恒温震荡空气浴摇床:EYELA  NTS-4000BH  (控温:》60度)

氮吹仪 EYELA MGS-2200 

超声波清洗器 PM5-2000TD

天平:感量为 0.1 mg  METTLER MS-204TS

HAIER 低温冰箱 DW-25L278 (-20度)保存标准品储备液

聚四氟乙烯漏斗

500ml分析漏斗 

快速滤纸

分液漏斗木头架

分液漏斗振摇器 EYELA MMV-1000W


分析检测方法步骤

1. 皂化:

1)准确称取样品:5-20g到250m皂化瓶中

2)加入40ml 含16g/l抗坏血酸的无水乙醇溶液,搅拌均匀后,加入氢氧化钾(KOH:H2O=1:1)25ml

3)确保在EYELA  NTS-4000BH 水浴振荡箱 60℃下皂化60min 摇匀,避光 ;使皂化完全,皂化后立即置于冰水浴冷却;


2.提取

1)皂化液转入500ml分液漏斗,用150ml石油醚提取于 EYELA MMV-1000W 分液漏斗振摇器振摇5min,静止5min分层


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2)分层后转移至另一个分液漏斗,加100ml石油醚同法萃取,合并醚液,

3)水洗有机相3次至中性

醚液过无水硫酸钠,用250ml鸡心瓶收集。

4)40℃EYELA N1300V-WB旋蒸蒸发旋蒸至1ml左右

5) 用约5ml石油醚洗待测组分于50ml塑料离心管,EYELA MGS-2200氮吹仪吹干。           

6) 用10ml色谱甲醇复溶解,涡旋混合仪混匀。

7)  样品过0.22μm滤膜,进样10ulAgilent 1220 HPLC .


维生素 A、D、E 测定色谱

色谱柱:Agilent 色谱柱:Prooshell 120 PFP (五氟苯基), 50 mm ×4.6 mm, 2.7μm,(备注:PFP柱对位置异构体具有良好的选择性的保留时间)

检测波长:维生素A(325nm);维生素:(294nm);维生素D:264nm。

波长检测方法:(0-4.5)min 325nm,(4.5-6)min 改变为294nm,5min左右切阀(时间长短0.4-0.45min)(6-15)min改变为264nm.

柱温:35 ℃±2 ℃。

进样量:10 μL。

时间:15min

流动相:一维:甲醇,水;流速::1ml/min;

维生素A D E 标准曲线的绘制


标准曲线的制作

本法采用外标法定量。将维生素 A 和维生素 E 标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。

    





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