近年来,质谱技术取得了快速的发展,除了在食品检测、环境监测、药物开发、法医毒理等领域得到广泛应用外,其在生命科学和临床检测中的应用也越来越广泛和深入,如维生素D和激素的检测、新生儿遗传代谢疾病筛查、治疗药物监测、细菌鉴定、蛋白组学、代谢组学等。与传统分析手段相比,质谱技术具有灵敏度高、特异性强、准确度高的优点。目前,临床上应用较广泛的是液相色谱串联质谱LC-MS/MS,该技术可以分析的化合物范围广(极性和非极性),且可以同时检测多个目标化合物,能够获取丰富的化合物结构信息,定性和定量功能强大。

  在使用LC-MS/MS开展临床质谱检测前,首先需要根据具体的分析对象开发相应的检测方法,并对方法进行验证,只有通过了性能验证后方可开展检测任务。由于临床检测的对象多为生物样本(如全血、血清、血浆、尿液、唾液、胆汁、组织等),因此要建立适合临床应用的质谱检测方法,首先要从生物样品的特性着手,结合质谱技术的特点,进行综合的研究和分析。下面就临床质谱检测方法的开发和性能验证做一介绍。LC-MS/MS检测方法的开发和验证大体分为五个步骤。

步骤一:文献搜集和查阅

  搜集相关的文献资料,查阅相关的检测方法,根据已有的方法结合本实验室条件选择相应的检测方法,具体考虑以下各个要素:

◇ 目标化合物的理化性质(结构式、分子量、沸点、酸碱性、极性强度)

◇ 目标化合物在临床上的意义(对检测方法和处理方式有哪些要求)

◇ 采集生物样本的类型(全血、血清、血浆、尿液、唾液、胆汁、组织等)

◇ 生物样本的采集方法和采集量(如随机尿、24h尿、晨尿,静脉血、足底血、指尖血)

◇ 样本处理、储存和运输方式(离心、静置、避光、冷藏、冷冻)

◇ 目标化合物在样品中的存在形式和预期浓度(游离态、结合态、有无类似物和代谢产物;常量级、微量级)

◇ LC-MS/MS法相对现有的其他方法优势(是否有必要选择LC-MS/MS法)

◇ LC-MS/MS法需要具备的仪器设备条件以及标准品、试剂、耗材等

◇ 样本的采集、处理、保存、运输以及检测等整个过程需要花费的时间、精力和成本

◇ 质谱方法(离子化方式、离子扫描方式、离子通道和相应的参数)

◇ 液相色谱方法(色谱柱选择、流动相组成和比例选择、洗脱方式和进样量)

步骤二:质谱方法建立和优化

◇ 配制标准物质溶液,直接引入质谱检测器进行质谱扫描,获取目标化合物的离子信息(可选择ESI、APCI、APPI等离子化方式和正负离子模式)

◇ 临床LC-MS/MS多为定量检测,常采用多反应监测MRM和选择性反应监测SRM模式选择定量离子对和定性离子对(满足灵敏度和特异性的条件下选择响应高、选择性和稳定性好的两对离子对作为定性和定量离子对)

◇ 优化质谱离子源参数和扫描参数使所选离子对信号最强

步骤三:液相方法建立和优化

◇ 色谱柱的选择(色谱柱填料的选择如弱极性的C18、C8、C4、苯基柱等和极性固定相的氨基柱、氰基柱、硅胶柱等;色谱柱耐压范围和pH适用范围)

◇ 流动相的选择(如甲醇、乙腈和水等)及纯度要求(超纯水、色谱级、质谱级等)

◇ 流动相添加剂的选择和加入量(挥发性的甲酸、乙酸、甲酸铵、乙酸铵等,尽量不加硫酸盐、磷酸盐等不挥发盐,以免影响离子化效率和仪器损坏)

◇ 洗脱方式(等度洗脱、梯度洗脱以及其起始比例选择)、进样量、柱温、运行时间等

◇ 将待测物的纯物质经液相色谱保留和分离,优化色谱流动相比例、流速、改良剂加入量或改变色谱柱类型以便目标化合物得到较高的分离度,降低基质干扰,提高目标物响应强度

步骤四:样品前处理方法建立和优化

  生物样品基质复杂,且待测目标物多为内源性的化合物,因此为了降低基质干扰、延长色谱柱使用寿命、防止系统堵塞损坏、提高检测灵敏度和特异性,往往需要对样品进行沉淀、萃取、净化、富集等前处理。可根据目标物的特性和样品的类型来选择合适的前处理方法。

◇ 样品的沉淀(蛋白沉淀,选择合适的蛋白沉淀剂如乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、酸等)

◇ 萃取、净化和富集(液液萃取、液固萃取、固相萃取、超滤等;旋转蒸发、氮气吹扫等),极性较小的化合物可采用液液萃取的方法进行萃取,酸性、碱性以及其它极性较强的化合物大多需要经过固相萃取进行净化和富集

◇ 样品的衍生化(目标物响应信号差或极性太强等可采用衍生化法)

◇ 样品的复溶(最好以初始流动相为复溶液对目标物进行复容)

◇ 自动化样品前处理系统(样本量大,资金允许的实验室可考虑引进自动化前处理系统如在线固相萃取系统Online SPE,但仍需考虑系统配备后的方法开发难度、设备维护、操作人员培训等诸多因素)

步骤五:方法学性能验证

  LC-MS/MS临床检测方法建立之后,在用于临床检验之前,必须对新建方法进行全面、严格的性能验证,确保检测方法准确性高、可靠性强、重复性好,能够为临床诊断提供合格的数据。

◇ 精密度实验(批内和批间精密度,考察方法的稳定性和重现性)

◇ 回收率实验

◇ 最低检测限(LLOD)和定量限(LLOQ)以及检测线性范围,方法灵敏度是否能够满足临床检测需求以及临床可报告范围

◇ 基质效应、干扰试验、携带效应

◇ 生物样品稳定性、前处理后样品稳定性

◇ 质控品验证,检测方法准确度

◇ 方法参考值的建立与验证等

  

  方法通过性能验证之后,还需要对同一实验室不同操作人员因操作习惯和操作方式不同引起的结果差异性进行比对和考察评估。此外,在日常的临床检验过程中还需要长期观察和监测分析方法的稳定性,如目标分析物和内标物的信号响应强度、保留时间、峰形有无变化,定量和定性离子对的比值变化等,同时需要采用完善的质量控制措施,包括室内质控、室间质评等质量保证措施,确保检测结果的准确性和可靠性。



转自临床质谱检测




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